DOTAP 真核細胞轉(zhuǎn)染試劑

貨號：ZK-PL4131

品牌：子科生物ZIKER

描述：

DOTAP是一種陽離子脂質(zhì)體，可與DNA或RNA形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復合物進入細胞，并將核酸釋放入細胞內(nèi)。它以可靠性和高效性著稱，是廣泛使用的商品化轉(zhuǎn)染試劑。我們的DOTAP真核細胞轉(zhuǎn)染試劑是由DOTAP和中性輔助脂質(zhì)以特定比例融合制備而成的單層脂質(zhì)體懸液。這種制備方法增加了脂質(zhì)體對真核細胞轉(zhuǎn)染的高效性、廣譜性、低毒性和可靠性，并使試劑在4°C儲存至少穩(wěn)定12個月。DOTAP可高效轉(zhuǎn)染多種細胞，甚至在低濃度血清環(huán)境也可工作良好。它屬于可被生物降解的脂質(zhì)體因而細胞毒性明顯降低，其轉(zhuǎn)染效率高于Sigma公司的DOTAP單體轉(zhuǎn)染試劑，與Invitrogen的LipofectAMINE相當，但其價格僅相當同類試劑的1/3。

轉(zhuǎn)染時只需將稀釋的DOTAP試劑與DNA溶液混合并室溫放置15分鐘即可加入細胞。1ml DOTAP可轉(zhuǎn)染100-500μg DNA或50-100只35mm培養(yǎng)皿或250-1000孔24孔板細胞。

顏色：

清亮或略呈白色膠體溶液。

儲存：

4°C儲存12個月。切勿凍存。

適用：

將DNA、RNA、寡聚核苷酸轉(zhuǎn)入真核細胞。適用于大多數(shù)傳代或原代細胞。

效果展示：

DOTAP真核細胞轉(zhuǎn)染試劑(#C1510) LipofectAMINE

圖：293細胞于24孔板中生長至75%滿(confluency)，每孔細胞分別用DOTAP真核細胞轉(zhuǎn)染試劑(#C1510)和Invitrogen公司的LipofectAMINE轉(zhuǎn)染各0.5 μg pEGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24小時后觀察綠色GFP熒光。

以生長于24孔板的一個孔內(nèi)的貼壁細胞為例，使用其它規(guī)格培養(yǎng)皿參見表一。

細胞準備：

轉(zhuǎn)染前一天傳0.5-2 x 105細胞于24孔板內(nèi)，加1 ml正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。在光鏡下觀察細胞，當細胞群覆蓋培養(yǎng)瓶皿生長表面的85-95%時，為DOTAP轉(zhuǎn)染的最佳時機。這通常需要18-24小時，但依細胞類型和接種量而變。注意：傳代時接種過多的細胞，100%長滿的細胞的轉(zhuǎn)化效率明顯降低

制備轉(zhuǎn)染復合物：

對特定細胞類型來說，應該優(yōu)化加入DNA (μg)和DOTAP (μl)比率和絕對量，參見后面附表。推薦DNA和DOTAP的初始比例為1:4。DNA (μg) ：DOTAP (μl) ＝ 1:2～1:8

轉(zhuǎn)染實際上是人為造成細胞對外源物質(zhì)的高攝取狀態(tài)，因此過量攝入DNA和轉(zhuǎn)染試劑將導致細胞毒性而降低轉(zhuǎn)染效率。與細胞接觸的轉(zhuǎn)染混合物中DOTAP 的最大濃度不應超過30 μl/ml，DNA濃度應小于5μg/ml。參考表一制備轉(zhuǎn)染復合物，參照表二進行優(yōu)化。下面的步驟以生長于24孔板的單孔貼壁細胞為例。懸浮細胞轉(zhuǎn)染參見表一后面的說明。

1. 取1μg DNA稀釋到25μl 無血清無抗生素培養(yǎng)基，混勻。

2. 取2-8μl DOTAP 加入到25μl 無血清抗生素培養(yǎng)基，輕輕混勻。

3. 吸取稀釋的DNA溶液加入到稀釋的DOTAP溶液中，上下吹吸混勻，勿振蕩。室溫孵育15分鐘。

如果按照相反的順序?qū)⑾♂尩?/span>DOTAP溶液與DNA混合，將生成相反類型的DNA轉(zhuǎn)染復合物，有可能會導致轉(zhuǎn)染效率下降。

4. 在此期間用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞1-2次，按照表一Step 5加入適宜體積的無血清無抗生素培養(yǎng)基。

5. 加入步驟3獲得的轉(zhuǎn)染復合物于培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，輕輕混合與細胞充分接觸，開始轉(zhuǎn)染細胞。

6. 二氧化碳孵箱37C孵育細胞4小時。

7. 吸除轉(zhuǎn)染混合物，加入含血清的正常培養(yǎng)基；或直接將含血清培養(yǎng)基加到孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時以上。觀察細胞，進行下一步實驗?；?/span>1:10稀釋傳 代，進行G418篩選。

表一 DNA和轉(zhuǎn)染試劑稀釋表

懸浮細胞轉(zhuǎn)染：

懸浮細胞轉(zhuǎn)染與上述步驟類似：(1) 離心收取細胞，用不含血清培養(yǎng)基洗滌2次；將1 x 106 細胞混懸于1ml無血清培養(yǎng)基，加入6孔板內(nèi)。(2) 按照表一制備轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物加到懸浮細胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。(3) 二氧化碳孵箱培養(yǎng)4小時。(4) 吸除轉(zhuǎn)染混合物，換常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時以上。觀察細胞或進行下一步實驗如G418篩選。

轉(zhuǎn)染優(yōu)化程序：

對特定類型的細胞，欲獲得最大轉(zhuǎn)染效率和最低細胞毒性，應該對加入DNA和DOTAP的絕對量和比率、濃度等分別進行優(yōu)化，步驟參見表二。表二是生長于24孔板的單孔細胞為例進行優(yōu)化操作的。由于可以理解的心理因素，實驗人員在轉(zhuǎn)染時常常趨于加入過量的DNA和轉(zhuǎn)染試劑和使用更小的轉(zhuǎn)染復合物體積。從表二可以計算，如果每孔加入1 μg DNA和8 μl DOTAP，在200 μl轉(zhuǎn)染混合物中，DNA的濃度將為5μg/ml，DOTAP濃度達到40μl/ml，二者的濃度很容易產(chǎn)生細胞毒性；另外轉(zhuǎn)染混合物體積很少時不利于操作也不利于細胞生長，不利于獲得最佳轉(zhuǎn)染效率。作為參考，通常最后的轉(zhuǎn)染混合物中DNA濃度應小于5μg/ml，DOTAP濃度應<30～40 μl/ml。表二給出DNA和轉(zhuǎn)染試劑的量、比率、濃度等指標僅作為參考。

說明：

使用高純水和不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA、溶液、器皿。常規(guī)方法制備的質(zhì)粒DNA含有大量內(nèi)毒素，可明顯降低降低轉(zhuǎn)染效率。使用內(nèi)毒素清除劑 (Endotoxin Removal Reagent) #D1501清除內(nèi)毒素。