武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司主營(yíng)：動(dòng)植物,細(xì)菌,細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)

(1)75% (體積分?jǐn)?shù))酒精消毒孕鼠,在無(wú)菌條件下取出胎鼠,分離并切取脊髓,置于冷的無(wú)鈣、鎂的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。

(2)解剖顯微鏡無(wú)菌條件下仔細(xì)剝離脊膜及血管。

(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小，消化液37℃消化15-20min，每五分鐘振蕩一次；

(4)去掉上清，加入終止液終止消化，吹打10-15次，不能有氣泡，收集上清，剩余組織再消化一次。

(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入種植液1重懸，培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁30min；

(6)收集上清，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按6*105cells/孔種入六孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(7)培養(yǎng)第二天，全換液更換為種植液2；

(8)培養(yǎng)第四天，半量換液加入5uM的，24h全量換液；

(9)之后每周換液兩次。

原位雜交涉及的步驟：玻片的準(zhǔn)備和樣品固定，細(xì)胞或組織的預(yù)滲透處理，靶DNA變性（DNA原位雜交），探針制備，原位雜交過(guò)程，雜交后洗滌，探針（顯色）檢測(cè)。

玻片的準(zhǔn)備和樣品固定

對(duì)于染色體涂片，1：1的乙醇/醚處理的載玻片已能符合要求。對(duì)于組織切片的原位雜交，為了在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不丟失組織樣品，可使用多聚賴氨酸或鉻礬明膠包被的載玻片。

樣品的固定步驟是為了保持樣品的原有形態(tài)學(xué)。樣品固定是原位雜交中的步驟，從化學(xué)反應(yīng)角度來(lái)看，固定劑的使用和選擇對(duì)后續(xù)雜交的影響不會(huì)太大，因?yàn)楹怂犭s交的功能分子基團(tuán)被安全地包裹在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，而交聯(lián)劑的使用對(duì)RNA基本沒(méi)有影響。對(duì)于染色體涂片，常使用/固定；石蠟包埋的組織切片用固定。冷凍切片可通過(guò)在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定劑。

SSC=150mMNaCl,15mM檸檬酸鈉溶液(pH7.4)

HCl處理：對(duì)樣本進(jìn)行20-30min的200mMHCl處理，可將蛋白抽提，并將核酸序列進(jìn)行一定程度的水解，增加雜交檢測(cè)的信噪比。

去垢劑處理：如果對(duì)樣品的固定、脫水、包埋等預(yù)處理過(guò)程不足以將脂膜成分破壞暴露核酸，可對(duì)樣品進(jìn)行額外的蛋白去垢劑處理(如TritonX-100和SDS)。

蛋白酶處理：樣品中待雜交的核酸序列常與蛋白纏繞交聯(lián)在一起，樣品的固定步驟更是加劇了蛋白的交聯(lián)程度，因此預(yù)滲透是核酸雜交前的常規(guī)步驟，通常通過(guò)蛋白酶K的消化作用來(lái)完成。根據(jù)不同的文獻(xiàn)來(lái)源，蛋白酶K的工作濃度通常設(shè)為10-500μg/ml(溶解于20mMTris-HCl,2mMCaCl2,pH7.4,酶濃度可根據(jù)具體樣品進(jìn)一步優(yōu)化)，對(duì)樣品進(jìn)行37°C7.5–30min的處理。染色體涂片或核片的蛋白酶K處理濃度可降至1μg/ml消化7.5min。也有文獻(xiàn)指出，固定石蠟包埋的組織切片樣品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mMHCl）將得到較好的蛋白消化結(jié)果。