描述：組織細(xì)胞總谷胱苷肽檢測(cè)試劑盒（Total Glutathione Assay Kit）是一種靈敏簡單的檢測(cè)總谷胱甘肽的試劑盒?？偣入赘孰陌ㄟ€原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSH 是細(xì)胞中巰基的主要來源，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基適當(dāng)?shù)难趸€原狀態(tài)有重要作用，動(dòng)物細(xì)胞中GSH占總谷胱甘肽比例約90-95%。

原理：GSH可以和DTNB反應(yīng)生成黃色的TNB和GSSG，利用該反應(yīng)可以通過測(cè)定生成TNB的吸光度（A_412nm）定量檢測(cè)GSH；另外谷胱甘肽還原酶可以將GSSG還原為GSH，在反應(yīng)體系中增加谷胱甘肽還原酶反應(yīng)，可以測(cè)定總谷胱甘肽，并能通過酶反應(yīng)將GSSG反復(fù)還原為GSH，從而極大提高GSH和DTNB顯色反應(yīng)對(duì)GSH檢測(cè)的靈敏度。本試劑盒以GSH為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)線性范圍為1.25-40μM，靈敏度≤1.25μM。

適用：本試劑盒能夠檢測(cè)動(dòng)物組織、培養(yǎng)細(xì)胞和多種其它生物樣本中的總谷胱甘肽含量。

組成：

儲(chǔ)存條件：-20℃儲(chǔ)存，12個(gè)月有效。NADPH配制成溶液后，可適當(dāng)分裝，-70℃儲(chǔ)存。GSH和DTNB溶解后，-20℃儲(chǔ)存。蛋白去除試劑S配制成溶液后4℃儲(chǔ)存。

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀，最佳工作波長412nm

操作步驟：

1. 樣品的準(zhǔn)備

1.1 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：收集新鮮細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入

200 μl的預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液，冰浴勻漿或超聲裂解細(xì)胞。4℃，10000g離心10分鐘。取上清和蛋白沉淀試劑S溶液1:1混合并渦旋。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中總谷胱甘肽超出測(cè)定范圍，可利用蛋白沉淀試劑S溶液適當(dāng)稀釋后測(cè)定，稀釋倍數(shù)可達(dá)10-20倍。

1.2 組織樣品的準(zhǔn)備：利用含1mMEDTA的PBS灌流或漂洗組織，去除組織中的血液，然

后取約20mg組織，加入400μl的預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液，冰浴勻漿。4℃，10000g離心10分鐘。取上清和蛋白沉淀試劑S溶液1:1混合并渦旋。4℃，10000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存。如果樣品中總谷胱甘肽超出測(cè)定范圍，可利用蛋白沉淀試劑S溶液適當(dāng)稀釋后測(cè)定，稀釋倍數(shù)可達(dá)10-20倍。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備

2.1 GSH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的6mg GSH中加入1ml的純水，溶解并混勻，即為GSH儲(chǔ)備液，濃度為20mM。

 2.2 DTNB儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4mg DTNB中加入1ml本試劑盒提供的DMSO溶解并混勻，即為DTNB儲(chǔ)備液，濃度為10mM。

 2.3 NADPH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的5mg NADPH中加入1ml純水，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)備液，濃度為5mg/ml。

 2.4 總谷胱甘肽檢測(cè)工作液的配制：根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)參考下表配制適當(dāng)量的總谷胱甘肽檢測(cè)工作液，表中試劑按比例混合后即為總谷胱甘肽檢測(cè)工作液。

2.5 NADPH工作液的配制：取NADPH儲(chǔ)備液，利用總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液稀釋10倍，配制為0.5mg/ml的NADPH工作液。每檢測(cè)一個(gè)樣品需要50μl的0.5mg/ml NADPH。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

將20mM的GSH儲(chǔ)備液用蛋白去除試劑S溶液稀釋成20、10、5、2.5、1.25、0.62μM濃度的GSH溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。由于GSH在蛋白去除S溶液中不夠穩(wěn)定，每次測(cè)定需新鮮配制系列標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

4、測(cè)定方法

4.1 參考下表，使用96孔板，依次加入總谷胱甘肽檢測(cè)工作液、樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后，混勻，25℃或室溫孵育2分鐘。

4.2  參考上表，各孔加入NADPH工作液50μl，25℃孵育20分鐘。

4.3 各孔加入NADPH工作液50μl啟動(dòng)谷胱甘肽還原酶反應(yīng)后，立即開始計(jì)時(shí)，并在5、10、20分鐘等時(shí)間點(diǎn)測(cè)定A_412nm。如果樣品吸光度較低，可適當(dāng)降低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，延長反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行樣品測(cè)定。

5. 數(shù)據(jù)處理

利用GSH標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和各樣品的吸光度值計(jì)算樣品的總谷胱甘肽濃度。由于有多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)曲，可以選擇標(biāo)曲線性最好的時(shí)間點(diǎn)計(jì)算樣品總谷胱甘肽濃度。GSH標(biāo)曲測(cè)定如下圖所示：

參考文獻(xiàn)

1.Akerboom, T.P., and Sies, H., 1981. Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples. Methods Enzymol., 77, 373-382.

     2. Nair, S. et al., 1991. Flow cytometric monitoring of glutathione content and anthracycline retention in tumor cells. Cytometry, 12, 336-342.

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒檢測(cè)涉及氧化還原反應(yīng)，很多氧化劑和還原劑都會(huì)干擾試劑盒的測(cè)定，特別是巰基乙醇、DTT等含有巰基的試劑會(huì)嚴(yán)重干擾本試劑盒的測(cè)定，請(qǐng)盡量避免。

2. 嚴(yán)格控制反應(yīng)的溫度和反應(yīng)時(shí)間，并在每次測(cè)定同時(shí)利用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中谷胱甘肽濃度過低時(shí)，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間。

3. NADPH在溶液中容易分解，要嚴(yán)格按儲(chǔ)存條件保存。

4. 初次使用試劑盒時(shí)，粉末試劑和小體積液體試劑請(qǐng)適當(dāng)離心后使用。

5. 本產(chǎn)品僅限專業(yè)人員用于科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

     6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。