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多種探針標(biāo)記檢測系統(tǒng)

基于地高3辛、生物素和熒光標(biāo)記分子的標(biāo)記和檢測系統(tǒng)是常見的原位雜交檢測方法。

熒光標(biāo)記檢測常為直接探針標(biāo)記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進行核酸標(biāo)記。由于標(biāo)記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過程中的考驗，以及熒光分子易于衰減，其檢測靈敏度受到一定的影響。但對熒光分子的直接檢測呈現(xiàn)的背景較低。

間接標(biāo)記的方法中應(yīng)用了報告分子標(biāo)記的探針，報告分子通過親和酶促的方法進行顯色。常用的報告分子如地高6辛，生物素。結(jié)合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進行間接的底物反應(yīng)檢測。地高6辛標(biāo)記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時使用的地高6辛抗6體不會結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測結(jié)果。但需注意，由于引入了免6疫檢測反應(yīng)，在放大檢測靈敏度的同時，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測背景。

通過不同標(biāo)記方法的聯(lián)合應(yīng)用，還可在同一樣本中實現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

使用分支DNA信號擴增的RNA FISH

Invitrogen? ViewRNA?和PrimeFlow?檢測是使用分支DNA信號擴增 (bDNA) 來檢測特異性信號的直接熒光RNA ISH方法。 使用獨立但兼容的信號擴增系統(tǒng)讓RNA靶標(biāo)的多重復(fù)用成為可能。 熒光RNA原位雜交檢測分為四個主要步驟：樣本制備、靶標(biāo)雜交、信號擴增以及檢測。 該方法可實現(xiàn)更高的特異性，更低的背景值和更高的信噪比。