BCA法蛋白定量試劑盒

產(chǎn)品及特點

本產(chǎn)品是基于 BCA 法（bicinchoninic acid，二奎啉甲酸法）蛋白檢測原理開發(fā)的蛋白質(zhì)濃度測定產(chǎn)品，BCA 法跟 Lowry 法的一步完全相同，就是在堿性條件下，藍色的 Cu2+被蛋白質(zhì)還原成紫色的 Cu+。此反應類似 Cu2+與 Biuret（NH2-CO-NH-CO-NH2，雙縮尿）發(fā)生的反應，故又叫 Biuret 反應（Biuret反應本省就可以測定蛋白質(zhì)濃度，目前仍然是醫(yī)院血液蛋白定量的方法）。第二步，Cu+與 BCA 發(fā)生反應形成水溶性的紫色化合物，通過分光在 562 nm處測定紫色化合物的量就可以精確定量蛋白質(zhì)濃度。BCA 檢測靈敏度比 Biuret 反應高 100 倍左右。

一步

Biuret 反應

第二步

BCA 反應

此方法的特點如下。

1. 對各種常見的去污劑不敏感，但對 Cu 的還原劑和螯合劑比較敏感。

2. 比 Lowry 法更加簡單快捷，45 分鐘內(nèi)完成測定。

3. 試劑穩(wěn)定，室溫可以放置兩年。工作液 1 天內(nèi)有效。

4. 線性范圍在 20～2000 μg/mL。如果需要范圍在 0.1-10ug/mL，需要選

用超敏 BCA。

5. 最小測量體積為 1-20 uL。

6. 終產(chǎn)物穩(wěn)定，變異系數(shù)遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。

7. 可以檢測最短到雙肽，而 Bradford 法需要一定大小的蛋白質(zhì)。

8. 有常規(guī)（試管）和微量（96 孔板）兩種檢測模式。

運輸及保存 常溫運輸和保存，但 BSA 標準品需要低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。

自備試劑 樣品緩沖液

使用方法 一：96 板操作模式

1、 取一塊 96 孔板，先進行編號（編號可以根據(jù)樣品數(shù)增加），并按照下表加入

BSA 標準，待測樣品和溶解待測樣品的緩沖液(可以用水替代)：

編號

BSA 標準

（2ug/μL）

待測樣品

（μL）

樣品緩沖液

（μL）

總體積

（μL）

蛋白含量

（μg）

0 0 0 20 20 0

1 1 0 19 20 2.0

2 2 0 18 20 4.0

3 4 0 16 20 8.0

4 8 0 12 20 16.0

5 12 0 8 20 24.0

6 16 0 4 20 32.0

7 20 0 0 20 40.0

樣品 1 0 X 補到 20 20 未知

樣品 N 0 Y 補到 20 20 未知

2、 計算 BCA 工作液需要量：根據(jù)樣品數(shù)量（包括制備標準曲線的樣品的數(shù)量）和每個樣品需要 0.2 mL BCA 工作液的比例，計算所需 BCA 工作液的用量，然后加上 10%損耗作為實際需要配制的量。例如：計算出需要 5mL 工作液，實際按不少于 5.5 mL 的量配制。

3、 配制 BCA 工作液：按 50 體積溶液 A 加 1 體積溶液 B（50:1）的比例將二者充分混合，所得溶液即 BCA 工作液。比如：5 ml 溶液 A + 100 μl 溶液

B。注意：取用溶液 A 和溶液 B 前需要充分搖勻，溶液 B 非常容易形成沉淀，需要 65℃加熱溶解后才能使用。當把溶液 B 剛加入到溶液 A 中時，最初會出現(xiàn)淡綠色沉淀，輕微晃動沉淀即會消失，工作液后成綠色，可以室溫放置 12 天，但需要將容器的蓋子擰緊。

4、 將 10 倍體積（20μL 的 10 倍體積即 0.2 mL）的 BCA 工作液加入到各孔中并混勻。也可把 96 孔板放在振蕩器上振蕩 30 秒混勻。

5、 37℃放置 30 分鐘。

6、 冷至室溫，10 分鐘內(nèi)完成后續(xù)測定，否則化學反應還在繼續(xù)進行，使光吸收值慢慢升高，每 10 分鐘會升高 2.5%左右。

7、 在 562 nm 下比色測定樣品的光吸收。如酶標儀沒有 562 nm 的設定，可用接近的波長檢測，如 570 nm。

8、 將編號為 0 號的樣品（對照）的讀數(shù)從其余所有樣品（包括 0 號樣品，其讀數(shù)變成零）中扣除。

9、 以 0-7 號樣品的 BSA 含量（μg，見上表最右行）為橫坐標，以樣品的吸光值為縱坐標，繪出 BSA 的標準曲線。

10、再將待測樣品的吸光值（減去 0 號樣品的讀數(shù)后的值）標在標準曲線上，其在橫坐標上對應的蛋白含量（μg）就是待測樣品中的蛋白質(zhì)含量，除以樣品稀釋液總體積（20 μL），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品濃度（μg/μL）。

二：試管測定模式

1、 基本操作同上，只是操作改在編號的玻璃試管中進行，同時 BSA 標準品（2ug/uL）的使用量從低到高改為 0、5、10、20、40、60、80、100uL，樣品的總體積從 20uL 改為 100uL，BCA 工作液的用量從每個樣品 0.2 mL改為 2 mL。

三：注意事項

1、 BCA 法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。所以，如果蛋白質(zhì)濃度較低，可以改在 60℃孵育 30分鐘或更長。

2、 待測樣品濃度在 20～2000 微克/毫升濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

3、 在一定濃度范圍內(nèi) BCA 法測定蛋白濃度不受下列化學物質(zhì)的影響：

名稱 在此濃度下不受影響

Ammonium Sulfate 1.5 M

Brij-35 5.0%

CHAPS 5.0%

EDTA 10 mM

Hepes 100 mM

Glycine, pH 2.8 100 mM

Guanidine HCl 4.0 M

Tween 20、60、80 5.0%

SDS 5.0%

Sodium Acetate pH 5.5 200 mM

Sodium Chloride (NaCl) 1.0 M

Sucrose 40%

Sodium Hydroxide (NaOH) 0.1 M

NP-40 5.0%

Triton X-100 5.0%

Urea 3.0 M

4、 本方法受樣品中螯合劑和還原劑的影響，所以需確保 EDTA 濃度不高于10mM，二硫蘇糖醇不高于 1mM，β-巰基乙醇不高于 1mM，沒有任何EGTA，否則建議使用 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（CAT#:80815）。