熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

人基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)ELISA試劑盒 Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody100 ul

人基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA試劑盒Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody100 ul

人基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)ELISA試劑盒Histone H2A Antibody II100 ul

人基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP11)ELISA試劑盒GIRK2 (D6C2T) Rabbit mAb100 ul

人基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒Ribosomal Protein S3 Antibody100 ul

人基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)ELISA試劑盒MAGE-A3 Antibody100 ul

人基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)ELISA試劑盒 Keratin 5 (D4U8Q) Rabbit mAb100 ul

人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(MEPE)ELISA試劑盒 Phospho-Stat1 (Tyr701) (D4A7) Rabbit mAb (PE Conjugate)100 ul
雷氏普羅威登斯菌探針法熒光定量PCR試劑盒尿苷二磷酸-α-D-半乳糖ul-13c6 ] [鈉15.625-1000pg/mlPLAU|uPA|PLAU|Urokinase|ATF|plasminogen activator|urokinase|UPA|u-PA|U-plasminogen activator|urinary|urokinase-type plasminogen activator

d-homo布地奈德0.78-50ng/mlGaa|Acid alpha-Glucosidase|Acid Maltase|LYAG|Acid maltase|Aglucosidase alfa

群多普利酰基β- d-glucuronide，8578-5000pg/mlBdh1|BDH|3-hydroxybutyrate dehydrogenase

d-glucitol-4,5-d231.25-2000pg/mlNucb2|NEFA|Prepronesfatin|DNA-binding protein NEFA|Gastric cancer antigen Zg4|nucleobindin 2

6-maleimidocaproic酸磺基-N-琥珀酰亞胺基酯1.56-100mIU/mlRln3|H3|INSL7|M3|RXN3|ZINS4|H3|insl7|relaxin 3|ZINS4|Insulin-like peptide INSL7|Insulin-like peptide 7|Prorelaxin H3

1,5-diazido-3-oxapentane15.625-1000ng/mlSerpina6|Cbg|Serpin A6

（1S，4S）- N-去甲基鹽酸舍曲林156-10ng/mlCryab|CRYA2|CTPP2|HSPB5|alpha B crystallin|alpha(B)-crystallin|Alpha(B)-crystallin|CRYA2alpha crystallin B chain|crystallin|alpha B|CTPP2|Heat shock protein beta-5|heat-shock 20 kD like-protein|HspB5|HSPB5|Renal carcinoma antigen NY-REN-27|Rosenthal fiber component

（S）-丁呋洛爾鹽酸鹽7.813-500pg/mlGusb|Beta-G1|MPS7|beta-D-glucuronidase|beta-G1|Beta-G1|BG|EC 3.2.1.31|FLJ39445|glucuronidase|beta|MPS7

（11Z）- 16 - [ [ 2 -（甲基氨基）- 2-oxoacetyl ]氨基] - 11烯酸1.56-100mIU/mlGpt|Glutamic--pyruvic transaminase 1|Glutamate pyruvate transaminase 1(GPT 1)|Glutamic--alanine transaminase 1|

孟魯司特苯乙烯31.2-2000pg/mlFbln5|DANCE|EVEC|FBLN5|UP50|ARMD3fibulin-5|Dance|DANCEFIBL-5|Developmental arteries and neural crest EGF-like protein|EVEC|fibulin 5|UP50FLJ90059|Urine p50 protein

3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrrolidin-1-oxyl78-5000pg/mlLipf|LIPF(Lipase|Gastric)|GL|Gastric lipase|Gastric triacylglycerol lipase

2-deoxy-2-phthalimido-4-deoxy-3,6-di-o-acetyl -β乙酰-D-吡喃葡糖0.156-10ng/mlVav3

生度米星停止15.6-1000pg/mlAdm|adrenomedullin|AM

2-methyl-5 -（甲基）呋喃15.6-1000pg/mlCat|Cas1|CAT|Cs-1|catalase|EC 1.11.1.6|MGC138422|MGC138424

2-amino-6-methyl-4 -（甲基）吡啶0.23-15ng/mlMat1a|MAT1A|AMS1|MATA1|AdoMet synthase 1|S-adenosylmethionine synthase isoform type-1|Methionine adenosyltransferase 1

96%100g25g油菜甾醇136310935solution OX40 Ligand

肉豆蔻,十四 質(zhì)量規(guī)格：≥98%，BR Myristic acid

血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 CLM-9 / TREM4 / CD300LG 蛋白 (His 標(biāo)簽)現(xiàn)貨促銷1.10490.0500

antiRV IgG(Human antirubella virus IgG antibody) ELISA Kit  人抗風(fēng)疹病IgG抗體CAS號(hào)：18570二腺苷檢測(cè)試盒5gHuman/人Elisa試盒31558404

98%5g1g阿馬靈，阿義馬林107868304soluble major histocompatibility complex class I chainrelated gene B

 親環(huán)素A(CYPA)重組蛋白英文名稱：Recombinant Cyclophilin A (CYPA)

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 BTC / Betacellulin 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)特價(jià)供應(yīng)1.05409.0500

EBV(Human antiEpsteinBarr virus antibody) ELISA Kit  人抗EB病抗體CAS號(hào)：18451一腺苷檢測(cè)試盒100mgHuman/人Elisa試盒31562433

98%1g5g胰蛋白酶抑制劑Bruton'S Tyrosine Kinase

對(duì)基肉桂 質(zhì)量規(guī)格：AR,99% p-Methoxycinnamic acid  大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum屎腸球菌 Enterococcus faecium

現(xiàn)貨供應(yīng)CC趨化子1檢測(cè)試盒250mgHuman/人Elisa試盒505083045

98%1g1g胰蛋白酶抑制劑rheumatoid factor IgG

1,4-雙(三甲基硅基)-1,3-丁二炔(>99.0%(GC)) 質(zhì)量規(guī)格：>99.0%(GC) 1,4-Bis(trimethylsilyl)-1,3-butadiyne 佛羅里達(dá)側(cè)耳 Pleurotus florida

特價(jià)促銷類固醇硫酯酶檢測(cè)試盒10gHuman/人Elisa試盒505102

97%5g5g核糖核酶抑制劑rheumatoid factor IgA

甲新斯的明(標(biāo)準(zhǔn)品) 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>99%,標(biāo)準(zhǔn)品 Neostigmine methyl sulfate 釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae白蘑菇 Agaricus sp.

進(jìn)口、分裝磺基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試盒25gHuman/人Elisa試盒505102