定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準備

1. DNA模板

2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。

４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。

兔子前列腺素E1(PGE1)ELISA試劑盒Langerin (D9H7R) XP? Rabbit mAb20 ul

兔子催乳素(PRL)ELISA試劑盒Langerin (D9H7R) XP? Rabbit mAb500 ul

兔子孕激素/孕酮(PROG)ELISA試劑盒SimpleChIP? Human β-Actin Promoter Primers100 ul

兔子Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNT)ELISA試劑盒Stathmin (D1Y5A) Rabbit mAb100 ul

兔子血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) (Pacific Blue? Conjugate)100 ul

兔子血小板因子4(PF-4/CXCL4)ELISA試劑盒VCAM-1 (E1E8X) Rabbit mAb100 ul

兔子血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒ZO-1 (D6L1E) Rabbit mAb100 ul

兔子纖溶酶原(Plg)ELISA試劑盒 PI3 Kinase p85α (6G10) Mouse mAb100 ul
牛眼莫拉氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒酒石酸長春質(zhì)堿0.312-20ng/mlLRP11|Low-density lipoprotein receptor-related protein 11|LRP-11

桔皮素0.156-10ng/mlCell death protein RIP|Receptor interacting protein 1|RIP|RIP 1|RIP1|RIPK1

開環(huán)異落葉松樹脂酚 7.8-500ng/mlKIAA1377|Uncharacterized protein KIAA1377

開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷1.56-100ng/mlPDIA4|Protein disulfide-isomerase A4|Endoplasmic reticulum resident protein 70|ER protein 70|ERp70|Endoplasmic reticulum resident protein 72|ER protein 72|ERp-72|ERp72

柯諾辛78-5000pg/mlDPP7|DPPII|QPP|carboxytripeptidase|Dipeptidyl aminopeptidase II|dipeptidyl arylamidase II|dipeptidyl peptidase 2|Dipeptidyl peptidase 7|Dipeptidyl peptidase II|dipeptidyl-peptidase 7|DPP2|Quiescent cell proline dipeptidase

苦鬼臼毒素31.2-2000pg/mlTPSG1|Tryptase gamma ?1|gamma I|gamma II|lung tryptase|mast cell protease II|mast cell tryptase|PRSS31skin tryptase|Serine protease 31|Transmembrane tryptase|trpA|tryptase gamma|tryptase gamma 1|tryptase gamma I|tryptase gamma II

奎寧0.312-20ng/mlPDK1|PDPK1|[Pyruvate dehydrogenase [lipoamide]] kinase isozyme 1|mitochondrial|mitochondrial pyruvate dehydrogenase|lipoamide|kinase isoenzyme 1|Pyruvate dehydrogenase kinase isoform 1|pyruvate dehydrogenase kinase|isoenzyme 1|pyruvate dehydrogenase kinase|isozyme 1|PKB kinase

萊鮑迪苷0.78-50ng/mlKPRP|Keratinocyte proline-rich protein|Hkprp

櫟櫻酸   0.312-20ng/mlCYP7A1(Cytochrome P450 7A1)|Cholesterol 7-alpha-monooxygenase|CYPVII|Cholesterol 7-alpha-hydroxylase

連翹脂苷0.156-10ng/mlMYB|Transcriptional activator Myb|Proto-oncogene c-Myb

連翹脂素0.156-10ng/mlKYNU|kynureninase|L-kynurenine hydrolase

氯化木蘭花堿0.312-20ng/mlOAT|Ornithine aminotransferase|mitochondrial|Ornithine delta-aminotransferase|Ornithine--oxo-acid aminotransferase

羅漢果甜苷V0.312-20ng/mlPRG2|Bone marrow proteoglycan|BMPG|Proteoglycan 2

羅漢果甜苷VI0.156-10ng/mlDPP3|Dipeptidyl peptidase 3|Enkephalinase B|Dipeptidyl peptidase III|DPP III|Dipeptidyl aminopeptidase III

羅漢果皂苷IV31.25-2000pg/ml40S ribosomal protein S19|DBA|ribosomal protein S19|RPS19

Tripdiolide粘蛋白2檢測試劑盒20mg

多索茶堿 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR Doxofylline HCC38(人腺導管細胞)苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti

Stevenleaf阿莫曲坦標準品規(guī)格：規(guī)格：人水通道蛋白5(AQP-5)Polyclonal Antibody 0.2ml

AP13(Human apelin 13) ELISA Kit  人apelin 13CAS號：138681尼克酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒3047323

Triptolide粘蛋白3檢測試劑盒20mg

20(s)-人參皂苷Rg1; 訂購|咨詢 規(guī)格： 20mg 細胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運同源蛋白20抗體 RHPN2 ELISA Kit Rho蛋白2(RHPN2)ELISA試劑盒

Amygdalin依來曲普坦相關(guān)物質(zhì)A標準品規(guī)格：規(guī)格：人水通道蛋白1(AQP-1)Polyclonal Antibody 0.2ml

AP36(Human Apelin 36) ELISA Kit  人Apelin 36CAS號：11680 二酯酶5檢測試盒500gHuman/人Elisa試盒30484776

97%250mg25g性酶同工酶檢測試劑盒(抑制敏感法)Vitamin D Binding protein

防己諾林堿 質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標準品 Fangchinoline GNM(人口腔鱗頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細胞)5×106cells/瓶×2

Rabbit AntiGoat IgM Whole serum  兔抗羊IgM抗血清進口、原裝抗雙鏈DNAIgM抗體檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒483367108

95%1g500g性酶同工酶檢測試劑盒(熱穩(wěn)定性法)RV IgM

蓖麻油(分析標準品,99%) 質(zhì)量規(guī)格：分析標準品,99% Ricinoleic acid

Rabbit AntiGuinea IgG Whole serum  兔抗豚鼠IgG抗血清現(xiàn)貨供應M2型激酶檢測試盒25gHuman/人Elisa試盒4835909

95%25g100g性酶同工酶檢測試劑盒(熱穩(wěn)定性法)flapendo；exonuclease

 Nitsch培養(yǎng)基(含維生素)/Nitsch Medium with vitaminsBR10升國產(chǎn)/進口

Rabbit AntiGuinea IgM Whole serum  兔抗豚鼠IgM抗血清特價促銷凝血子Ⅷ檢測試盒5gHuman/人Elisa試盒4835909