服務(wù)流程：

1、根據(jù)客戶提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針（染料法只需設(shè)計(jì)引物）

2、抽提DNA、RNA，并對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

4、提供完整的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告(檢測(cè)數(shù)據(jù)、溶解曲線、擴(kuò)增曲線)

5、返還樣品（引物、RNA和cDNA）

樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

RNA質(zhì)量檢測(cè)：

腸賈第蟲探針法熒光定量PCR試劑盒圖片1）紫外吸收法測(cè)定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。

濃度測(cè)定

A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495的TE中，測(cè)得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g

取5ul用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 l，剩余RNA總量為：

35 l × 0.84 gl = 29.4 g

②純度檢測(cè)

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

使用方法：

一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。

2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）

以下是公司正在促銷打折產(chǎn)品：

1(RT-1狷羚病毒1型英文名稱  Anti-phospho-ASK1(Ser1033) 中文名稱  磷酸化細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1抗體 別    名  MAP3K5(phospho S1033); Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5; MAPK/ERK kinase kinase 5; MEK kinase 5; MEKK 5; Apoptosis signal-regulating kinase 1; ASK-1; MAP3K5; ASK1; MAPKKK5; MEKK5; M3K5_HUMAN. 濃    度  1mg/1ml 規(guī) 格  0.1ml/100μg  產(chǎn)品應(yīng)用   WB=1:100-500  ELISA=1:500-1000  IP=1:20-100  IHC-P=1:100-500  IHC-F=1:100-500  IF=1:100-500

阿留申病病毒英文名稱  Anti-AXUD1 中文名稱  轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)蛋白3抗體（半胱氨酸和絲氨酸富含核蛋白1） 別    名  Axin 1 Up-regulated; Axin-1 up-regulated gene 1 protein; CSRN1_HUMAN; CSRNP-1; CSRNP1; Cysteine/serine-rich nuclear protein 1; DKFZp566F164; FAM130B; Protein URAX1; TAIP 3; TAIP-3; TGF beta induced apoptosis protein 3; TGF-beta-induced apoptosis protein 3; URAX1. 濃    度  1mg/1ml 規(guī) 格  0.2ml/200μg  產(chǎn)品應(yīng)用   WB=1:100-500  ELISA=1:500-1000  IP=1:20-100  IHC-P=1:100-500  IHC-F=1:100-500  IF=1:100-500

交鏈孢霉屬通用英文名稱  Anti-phospho-ALK(Tyr1586) 中文名稱  磷酸化間變型激酶抗體 別    名  ALK (Phospho-Tyr1586); ALK(phospho-Y1586); p-ALK(Tyr1586); p-ALK(Y1586); ALK tyrosine kinase receptor precursor; ALK/EML4 fusion gene, included; ALK/NPM1 fusion gene, included; anaplastic lymphoma kinase (Ki-1); Anaplastic

梭砂貝母堿 中文別名：   湖貝甲素 英文名：   Hupehenine 英文別名：   Cevane-3,6-diol(3β,5α,6β,17β) CAS登錄號(hào)：   98243-57-3 分子式：   C27H45NO2 分子量：   415.65 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   無色針晶 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測(cè)定/鑒定/藥理實(shí)驗(yàn)等。 提取來源：   百合科(Liliaceae) 梭砂貝母 Fritillaria delavayi Franch. 溶解性：   可溶于酸性溶液，不溶于石油醚、氯仿等溶劑。 熔點(diǎn)：   181～182℃ 旋光度：   -20.0°(氯仿) ：   清熱,。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年 

千層紙素A-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷 中文別名：   木蝴蝶素A-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷; 木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷；千層紙素-7-葡萄糖醛酸苷 英文名：   Oroxyloside 英文別名：   Oroxylin A 7-O-glucuronide CAS登錄號(hào)：   36948-76-2 分子式：   C22H20O11 分子量：   460.39 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   黃色粉末 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測(cè)定/鑒定/藥理實(shí)驗(yàn)等。 提取來源：   紫葳科木蝴蝶（Oroxylum indicum） 溶解性：   溶于甲醇、乙醇、水等，不溶于石油醚、氯仿等溶劑。 熔點(diǎn)：   199-201 ℃ ：   具有一定的抗氧化作用。 貯存條件：   4℃冷藏、密封、避光 有效期：   2年

木蝴蝶苷B 中文別名：   木蝴蝶甙B 英文名：   Oroxin B 英文別名：   7-[(6-O-beta-D-Glucopyranosyl-beta-D-glucopyranosyl)oxy]-5,6-dihydroxy-2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one CAS登錄號(hào)：   114482-86-9 分子式：   C27H30O15 分子量：   594.52 分子結(jié)構(gòu)：      外觀：   黃色結(jié)晶 規(guī)格：   20 mg/支 純度：   ≥ 98% 用途：   用于含量測(cè)定/鑒定/藥理實(shí)驗(yàn)等。 提取來源：   紫葳科木蝴蝶（Oroxylum indicum） 溶解性：   溶于甲醇、乙醇、水等，不溶于石油醚、氯仿。 熔點(diǎn)：   177-178℃ ：   抗氧化、等作用。

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