*抑制大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)增殖

*類物質(zhì)是臨床上術(shù)后及癌癥晚期最常用的 鎮(zhèn)痛藥, 其可減輕疼痛, 減弱炎癥反應(yīng) [ 1] , 加快傷口 愈合 [ 2] , 并能消除焦慮 、緊張感 。但中斷或減量用藥 后機(jī)體生理功能發(fā)生紊亂 。長期用藥除了可產(chǎn)生明 顯的依賴癥狀外, 近些年來的動物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗 均表明*類物質(zhì)有抑制細(xì)胞增殖的作用 [ 3] , 本研 究組發(fā)現(xiàn), *能夠減弱 C6細(xì)胞核苷酸合成代謝關(guān) 鍵酶的基因表達(dá) [ 4] 。多巴胺能神經(jīng)元與*的成癮 與復(fù)吸有密切關(guān)系, 增加多巴胺釋放或阻斷多巴胺 被攝回到神經(jīng)元從而增加細(xì)胞外多巴胺濃度均可產(chǎn) 生獎賞效應(yīng) [ 5] 。 PC12細(xì)胞具有很多神經(jīng)細(xì)胞的特 征 [ 6] , *可能會抑制 PC12 細(xì)胞的增殖 。因此, 本 實(shí)驗研究*對 PC12細(xì)胞增殖的影響并探討其作 用機(jī)制 。 材 料 和 方 法 1 主要試劑 * (沈陽制藥廠 ), 納洛酮 (益橋湖南制藥有限 公司 ), L-多聚賴氨酸、MTT( Sigma), M-MLV逆 轉(zhuǎn)錄酶 ( Gibco), 馬血清 、胎牛血清 (杭州四季青 ), Trizol( Roche), Taq酶 ( Fermentas), RNA酶抑制劑 、 dNTPs( Promega), DEPC( Fluka), 兔抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原 ( PCNA)單*抗體 ( SantaCruz), 免疫組化 試劑盒 (武漢博士德 ), 其它均為國產(chǎn)分析純。 2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞 ( PC12 細(xì)胞 ) 購自 上海細(xì)胞所, 培養(yǎng)于含 10%馬血清 、5%胎牛血清 、 1 ×10 5 U/L、鏈霉素 100 g/L的高糖 DMEM培養(yǎng)基中。 培養(yǎng)器皿用 0.1 g/L的多聚賴氨酸包被, 在 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中待細(xì)胞長至對數(shù)生長期進(jìn)行傳代。 3 MTT法檢測*對 PC12細(xì)胞增殖的影響 對數(shù)生長期的細(xì)胞改用低血清 (含 2%馬血清 、 2%胎牛血清 )的 DMEM重懸, 以密度 10 8cells/L接 種于 96孔板, 100 μL/well, 培養(yǎng) 24 h使細(xì)胞同步進(jìn) 入 G0 期 。吸出培養(yǎng)液, 加入不同濃度的*, 以不 加藥物培養(yǎng)的細(xì)胞為對照, *的終濃度為 0.01、 0.1、1.0、10和 100 μmol/L。在 570 nm處檢測吸光 度 ( A)值 。抑制率 ( %) =(對照組 A-實(shí)驗組 A) /對 照組 A×100%。 4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期 將不同濃度的*加入 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 48 h, 胰 酶消化, 1 000 r/min離心 10 min, 棄上清, 0.01 mol/L 的 PBS重懸, 70%冷乙醇 4 ℃固定 30 min, RNase在 37 ℃消化 1 h, 50 mg/L碘化丙啶 4 ℃避光染色 30 min, FACScan流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞各周期時相變化。 5 *對 PC12細(xì)胞 PCNAmRNA表達(dá)的影響 細(xì)胞以 10 6 接種于培養(yǎng)瓶, 24 h后加入* ( M) 10 μmol/L作用 12 h、24 h、48 h和 72 h, 以生理鹽水 ( C)為對照, 并設(shè)計納絡(luò)酮 1 組 ( N+M) :納洛酮 1 μmol/L作用 1 h后, 加*作用 48 h;以及納絡(luò)酮 2 組 ( M+N) :*作用 48 h后, 加納洛酮作用 1 h。 將細(xì)胞用 1 mLTrizol試劑提取總 RNA, 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng), 并對 PCNA基因進(jìn)行擴(kuò)增, 以大鼠的 β -actin 基因為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn), 產(chǎn)物在 1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳, 相對表達(dá)量根據(jù)目的基因電泳區(qū)帶與內(nèi)參照 β -actin帶的總強(qiáng)度值之比來計算。 PCNA上游引物為 5-CTACAGAGCATGGATTCGTC-3, 下游引物為 5-CTGTAGGAGACAGTGGAGTG-3, 擴(kuò)增長度為 565 bp;大鼠 β -actin上游 引物為 5-AAGAGAGGCATCCTGACCCT-3, 下游 引物為 5-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3, 擴(kuò)增 長度為 218 bp片段。 6 免疫細(xì)胞化學(xué)法測定 PCNA蛋白表達(dá) 藥物處理分為 4組:( 1)對照組;( 2)加入*孵 育 72 h;( 3)納洛酮阻斷 1 h后加*作用 72 h;( 4) 為*作用 72 h后加納洛酮阻斷 1 h。貼壁生長于玻片上的細(xì)胞, 滴加甲醛固定 10 min, 再用丙酮固定 干燥, 1%BSA封閉, 1%H2 O2 阻斷內(nèi)源性過氧化物 酶 10 min, 滴加 PCNA單*抗體, 再加生物素化的 Ⅱ抗, 顯色 10 min, 乙醇脫水, 加甘油, 封片, 顯微鏡 下觀察, 圖像分析儀報告陽性染色的平均吸光度。

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