【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬痢疾蛇形螺旋體(SH)熒光PCR檢測試劑盒

Name ：Real-Time PCR Method

【包裝規(guī)格】48T/盒

豬痢疾蛇形螺旋體(SH)熒光PCR檢測試劑盒【預期用途】

本試劑盒適用于檢測標本中指標的定量檢測，輔助診斷。

【試劑組成】

名 稱	規(guī) 格
酶液	50μL×1 管
反應液	1.0mL×1 管
陽性質(zhì)控品	50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品	250μL ×1 管
核酸提取液	1.5ml×2管

詳見說明書

注：

1） 不同批號試劑不能混用。

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【檢驗原理】

本試劑盒對指標特異核酸序列設計引物和探針，用一步法熒光RT-PCR 技術對指標 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

【標本采集】

咽拭子：應使用與用采樣拭子，適度拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應避免觸及舌 部 ； 迅 速 將 拭 子 放 入 標 本 采 集 管 中 ， 旋 緊 管 蓋 并 密 封 ， 以 防 干 燥 。

全血：疑似感染病人的靜脈血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管，8000rpm 離心 2min，取適量上清液于 1.5mL 滅菌離心管中。痰： 以清晨的 口痰為宜。先用清水漱口，囑患者用力咳出深部的痰于無菌樣本保存管，密封，即可送檢。

【標本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但丌能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

1.2DNA 提取

1) 對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2 RNA 提取

推薦采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑	反應液	酶液
用量	20μL	1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟	循環(huán)數(shù)	溫度	時間	收集熒光信號
1	1 cycle	42℃	20min	否
2	1 cycle	95℃	10min	否
3	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

豬痢疾蛇形螺旋體(SH)熒光PCR檢測試劑盒【注意事項】

① 所有操作嚴格按照說明書進行；

②試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；

③反應液應避光保存；

④反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

⑤使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

⑥樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

⑦實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

⑧試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且有明顯的擴增曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線則為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性

① 樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

②樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

③陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

④病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

⑤不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

⑥試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺動物，取水泡皮及水泡液；待檢活動物，取 O/P 液 2~3mL。<